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Valutazione di genotipi, endosimbionti e caratteristiche cliniche di Acanthamoeba guarita da infezione oculare

Aug 11, 2023Aug 11, 2023

BMC Infectious Diseases volume 22, numero articolo: 757 (2022) Citare questo articolo

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L’Acanthamoeba è un patogeno emergente, noto per la sua resistenza ai composti antiprotozoari, ai disinfettanti e agli ambienti difficili. È noto che provoca cheratite, un'infezione corneale pericolosa per la vista, dolorosa e difficile da trattare, spesso segnalata tra i portatori di lenti a contatto e i pazienti con traumi oculari. Acanthamoeba comprende oltre 24 specie e attualmente sono stati identificati 23 genotipi (T1-T23).

Questo studio retrospettivo è stato progettato per esaminare le specie e i genotipi di Acanthamoeba recuperati da pazienti affetti da cheratite da Acanthamoeba (AK), determinare la presenza di endosimbionti negli isolati oculari di Acanthamoeba e rivedere le presentazioni cliniche.

In questo studio sono stati inclusi tredici pazienti con AK con conferma colturale trattati in una struttura di cura oculistica terziaria a Hyderabad, in India, da febbraio a ottobre 2020. Le manifestazioni cliniche, i farmaci e i risultati visivi di tutti i pazienti sono stati ottenuti dalle cartelle cliniche. Gli isolati di Acanthamoeba sono stati identificati sequenziando il gene della subunità nucleare ribosomiale (rns). Gli isolati di Acanthamoeba sono stati valutati per la presenza di endosimbionti batterici o fungini utilizzando saggi molecolari, PCR e ibridazione in situ fluorescente (FISH).

L'età media dei pazienti era di 33 anni (SD ± 17,4; IC al 95% da 22,5 a 43,5 anni). Sei casi (46,2%) avevano fattori di rischio associati all'AK; quattro pazienti avevano un trauma oculare e due erano portatori di lenti a contatto. A. culbertsoni (6/13, 46,2%) era la specie più comune, seguita da A. polyphaga e A. triangularis. La maggior parte degli isolati (12/13) appartenevano al genotipo T4 e uno era T12; tre sottocluster T4A, T4B e T4F sono stati identificati all'interno del genotipo T4. Non è stata riscontrata alcuna associazione significativa tra i tipi di Acanthamoeba e gli esiti clinici. Otto isolati (61,5%) ospitavano batteri intracellulari e uno conteneva Malassezia restretta. La presenza di microbi intracellulari era associata a una percentuale maggiore di infiltrati stromali (88,9%, 8/9), difetti epiteliali (55,6%, 5/9) e ipopione (55,6%, 5/9) rispetto al 50% (2/ 4), 25% (1/4) e 25% (1/4) di casi di AK senza microbi intracellulari, rispettivamente.

Il genotipo T4 era l'isolato predominante nell'India meridionale. Questa è la seconda segnalazione di genotipo T12 identificato da un paziente con AK in India, che viene raramente segnalata in tutto il mondo. La maggior parte degli isolati clinici di Acanthamoeba in questo studio conteneva microbi intracellulari, che potrebbero avere un impatto sulle caratteristiche cliniche dell’AK.

Rapporti di peer review

La cheratite da Acanthamoeba (AK) è una malattia oculare rara che rappresenta il 2% delle infezioni corneali globali [1]. Tuttavia, forse a causa dell’aumento dell’uso di lenti a contatto e della crescente prevalenza delle specie Acanthamoeba in diverse risorse idriche, comprese le piscine artificiali e persino le riserve idriche domestiche trattate [2], i casi di Acanthamoeba stanno aumentando a livello globale. L’uso delle lenti a contatto sta aumentando in tutto il mondo, in parte grazie allo sviluppo di lenti a contatto in grado di controllare la progressione della miopia nei bambini, e questo potrebbe metterli a rischio di sviluppare infezioni da AK che possono portare alla cecità [3]. Il legame tra AK e uso di lenti a contatto è fermamente stabilito poiché l’uso di lenti a contatto è associato a quasi il 90% delle infezioni segnalate [4]. Le epidemie segnalate sono state collegate a soluzioni disinfettanti per lenti a contatto inefficaci [5, 6]. Il ciclo vitale dell'Acanthamoeba comprende un trofozoite infettivo e lo stadio di cisti dormiente; quest'ultimo potendo rimanere vitale per un certo numero di anni [7].

L’AK è difficile da diagnosticare e i regimi terapeutici efficaci sono molto limitati [8, 9]. Le cisti di Acanthamoeba sono resistenti ai disinfettanti, ai farmaci antiprotozoari e alla deplezione dei nutrienti, rappresentando una sfida formidabile per la cura del paziente [10]. Inoltre, molti dei farmaci più comuni per il trattamento delle infezioni oculari non sono efficaci contro l’Acanthamoeba. Poiché la diagnosi e la gestione dei pazienti con AK sono difficili, ciò può portare a tempi di trattamento prolungati e il successo del trattamento diventa estremamente difficile, portando a una sostanziale perdita della vista [11]. Nel 30% dei pazienti con AK sono necessari interventi chirurgici per controllare la malattia e in rari casi viene rimosso l'occhio infetto [12]. Inoltre, le cisti di Acanthamoeba sono difficili da eradicare dopo che l’infezione si è stabilita e ciò può provocare una recidiva dell’infezione [13]. Una diagnosi corretta è essenziale per il successo della terapia, ma poiché i segni e i sintomi clinici dell’AK variano e alcuni sono simili ad altre infezioni oculari come la cheratite da virus herpes simplex (HSV), la diagnosi può essere difficile. Mentre viene stabilita la diagnosi è probabile che vengano prescritti analgesici, antinfiammatori e composti antimicrobici generali. L’uso precedente di corticosteroidi topici prima della diagnosi di infezione corneale da Acanthamoeba è associato a risultati visivi peggiori [14]. L'AK con sospetta resistenza alle soluzioni per lenti a contatto multiuso e ai rimedi antiameba consolidati richiedono modalità diagnostiche sensibili con nuovi approcci terapeutici [15].

 90% trophozoites) grown axenically were collected in 1.5 ml eppendorf tubes and centrifuged for 5 min at 3,000 g to harvest trophozoites. The cell pellet was washed twice with 1X Page’s saline and 30µL of amoebic suspension was transferred on poly-l-lysine coated slides (Thermo Scientific, Braunschweig, Germany) and left for 30 min at ambient temperature. The adherent cells were fixed by applying 30µL of freshly prepared 4% formaldehyde (buffered, pH 6.9) for 25 min. The attached amoebal cells were washed with 1X PBS, dehydrated in increasing ethanol concentrations (50%, 80%, and 96%, 3 min each) and air-dried. Intracellular bacteria were examined by hybridization using Cy3 labelled bacterial-domain specific probe EUB338 [41], and fungi using the fungus-specific probe PF2 conjugated with Hex and a Cy5 labelled EUK516 probe (Table 1) [42] for eukaryotic 18S rRNA (Biomers, Ulm, Germany). Aliquots (1µL of 50 ng/µL) of each probe were mixed with 9µL of hybridization buffer (20 mM Tris–HCl, pH 7.1, 900 mM NaCl, and 20% v/v formamide, 0.01% SDS) and added to the fixed amoebal cells on slides. Hybridization was carried out for at least 90 min at 46 °C in the dark after which slides were rinsed with 20µL of pre-warmed (48 °C) buffer (180 mM NaCl, 20 mM Tris/HCl, pH 7.2, and 0.01% SDS). The slides were then covered with 200µL buffer and a washing step was performed at 48 °C for 25 min. All slides were quickly immersed in ice-cold MilliQ water, air dried, and were mounted using Prolong Diamond Antifade with DAPI (Thermo Fisher Scientific), then mounted slides were left overnight to cure at room temperature in the dark before imaging. Three independent assays were performed and at least 30 amoebal host cells were visualized under Olympus FV1200 confocal laser scanning microscope in Katharina Gaus Light Microscopy Facility of UNSW and FISH images were analysed in ImageJ [43]./p> 0.05). Two patients (25%, 2/8) infected by Acanthamoeba with bacterial endosymbionts had received antibiotics along with antiamoebic drugs and the ulcers of both cases were resolved after medication./p> 4 mm) was observed in 3 (23.1%) cases. Epithelial defect was noted in 6 cases (46.2%; 6.2 ± 1.7 mm), stromal infiltrates in 10 cases (76.9%; 5.0 ± 2.2 mm), and hypopyon in 6 cases (46.1%; 1.12 ± 0.6 mm). The median duration of symptoms onset was 20 days (IQR = 15—30) and the final visual acuity was not improved by ≥ 2 lines among patients with farming background (5/5, 100%), age > 32 years (4/6, 80%) and patients showing AK symptoms more than 20 days (3/6, 50%) (Additional file 1: Table S3). PHMB and chlorohexidine were the most common treatments in this study (11 cases; 84.6%). Three cases received antibiotics, one case antiviral and one case antifungal as supportive therapy (38.5%); for these there was no improvement (p > 0.05) in BCVA at final presentation compared to cases treated only with PHMB and chlorohexidine. Overall, the median duration of medical treatment was 38 days (IQR = 23—90). Of six cases with surgical treatment, 4 cases had therapeutic penetrating keratoplasty (TPK, n = 4), including one case that had an amniotic membrane transplant (Table 4). Of the remaining two cases, one had photodynamic antimicrobial therapy with rose bengal (RB-PDAT) and one underwent evisceration. Among 6 patients who had to undergo ocular surgery, 66.7% (4/6) were infected by Acanthamoeba strains with intracellular bacteria./p> 32 years (80%) and cases showing keratitis symptoms for > 20 days (50%). A study from the UK has also reported worst clinical outcomes for AK patients aged > 34 years [56]. Corneal integrity weakens with age and the higher incidence of dry eyes among older populations may be possible predisposing factor for severe form of AK [9]. A previous study of bacterial keratitis from LVPEI supports the association of epithelial defect size with VA loss found in the current study [57]. Patients’ professions are often linked with the risk factors [55]. In the current study, among five cases having farming background, four (80%) had history of ocular trauma which may have been caused by non-sterile external matters as framers are frequently exposed to outdoor activities and three patients (75%, 3/5) were infected by Acanthamoeba strains with intracellular bacteria. All four cases had to undergo ocular surgery but visual acuity was not improved even after postoperative recovery. Ocular trauma with contaminated objects may be an ideal vehicle for invasion of Acanthamoeba cells leading to severe form of AK. Approximately 90% of AK patients with history of eye injury had corneal grafts to restore vision in Southern China [58]./p>

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