Hsa

Jul 29, 2023

Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 11432 (2022) Citare questo articolo

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Il nostro studio precedente ha dimostrato che hsa-miR-143-3p è uno dei miRNA altamente espressi nelle cellule staminali epiteliali corneali arricchite (CESC). Quindi questo studio mira a chiarire il ruolo normativo di hsa-miR-143-3p nel mantenimento della staminalità nei CESC. I geni bersaglio di hsa-miR-143-3p sono stati previsti e sottoposti ad analisi del percorso per selezionare i bersagli per gli studi funzionali. Le cellule epiteliali limbari in coltura primaria sono state trasfettate con la sequenza mimica, inibitrice o codificata di hsa-miR-143-3p utilizzando Lipofectamina 3000. Le cellule trasfettate sono state analizzate per (i) potenziale di formazione di colonie, (ii) espressione di marcatori di cellule staminali (SC)/ fattori di trascrizione (ABCG2, NANOG, OCT4, KLF4, ΔNp63), (iii) marcatore di differenziazione (Cx43), (iv) prediceva cinque target di hsa-miR-143-3p (DVL3, MAPK1, MAPK14, KRAS e KAT6A), ( v) Regolatori di segnalazione MAPK e (vi) Regolatori di segnalazione Wnt-β-catenina mediante qPCR, colorazione con immunofluorescenza e/o Western blotting. L'elevata espressione di hsa-miR-143-3p ha aumentato il potenziale di formazione di colonie (10,04 ± 1,35%, p < 0,001) con la capacità di formare colonie simili a olocloni rispetto al controllo (3,33 ± 0,71%). Le cellule trattate con la mimica avevano una maggiore espressione di marcatori SC ma una ridotta espressione di target Cx43 e hsa-miR-143-3p coinvolti nelle vie di segnalazione Wnt-β-catenina e MAPK. L'espressione di β-catenina, β-catenina attiva ed ERK2 nelle cellule trasfettate con l'inibitore hsa-miR-143-3p era superiore rispetto alle cellule di controllo e l'espressione nucleare localizzata indicava l'attivazione della segnalazione Wnt e MAPK. Pertanto, è stata quindi indicata la probabile associazione di hsa-miR-143-3p nel mantenimento delle CESC attraverso l'inibizione delle vie di segnalazione Wnt e MAPK.

La cornea e il film lacrimale costituiscono la finestra trasparente anteriore dell'occhio, che funge da barriera fisica tra l'ambiente ottico e quello esterno. L'epitelio corneale è lo strato più esterno della cornea e viene rigenerato dalle cellule staminali epiteliali corneali (CESC) presenti nello strato basale dell'epitelio limbare1. Queste cellule staminali residenti nei tessuti adulti costituiscono il 3-5% dell'epitelio limbare totale e sono normalmente quiescenti. Tuttavia, la funzione principale dei CESC è quella di governare processi come la guarigione delle ferite2 e l'omeostasi3 per mantenere la trasparenza corneale4. Il meccanismo molecolare alla base del mantenimento della staminalità nelle CESC non è ancora chiaro, inclusa la regolazione epigenetica da parte dei microRNA (miRNA).

I MiRNA sono RNA non codificanti a filamento singolo (da 18 a 24 nucleotidi) e regolano i livelli proteici dell'RNA messaggero bersaglio (mRNA) senza alcuna modifica nella sequenza genetica5. È noto che i MiRNA partecipano attivamente a vari processi cellulari come la proliferazione, la differenziazione, il metabolismo cellulare, l'omeostasi e l'apoptosi6,7.

Nel nostro studio precedente, le CESC sono state arricchite all'80% utilizzando un protocollo in due fasi8 e confrontate con cellule epiteliali corneali centrali differenziate mediante sequenziamento di piccoli RNA. Sono stati identificati sei miRNA: hsa-miR-3168, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-143-3p, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-10a-5p e hsa-miR-1910-5p essere altamente espresso nei CESC arricchiti e convalidato tramite qPCR. È interessante notare che, sulla base dell'ibridazione in situ dell'acido nucleico bloccato, è stato riscontrato che hsa-miR-143-3p è espresso nello strato basale dell'epitelio limbare, esclusivamente nei gruppi di piccole cellule che indicano la sua potenziale associazione con i CESC9. In seguito, in questo studio è stato valutato il ruolo funzionale di hsa-miR-143-3p nei CESC.

Nelle cellule staminali embrionali di topo, hsa-miR-143-3p ha promosso l'autorinnovamento e aumentato l'espressione di geni pluripotenziali come OCT4, KLF4 e ESRRB10. È noto che Hsa-miR-143-3p regola vari processi cellulari come la differenziazione11, la proliferazione12,13, la migrazione14, l'apoptosi15,16 e la regolazione del ciclo cellulare17.